Genomas II

Genomas II

 
Costo por megabase de secuencia de DNA, en azul,
datos reales; en blanco, datos esperados de acuerdoa la ley de Moore.
Fuente: National Human Genome Research Institute
Durante la última década, los avances en las tecnologías para secuenciación de DNA se han ido desarrollando con velocidad sorprendente. El costo por mega-base de DNA ha disminuido desde 5,292.39 USD en Enero del 2001, hasta llegar a 0.09 USD (nueve centavos de dólar)  en Octubre del 2011; es decir, aproximadamente 58,800 veces menos. A continuación presentamos una breve línea del tiempo sobre las llamadas tecnologías de Secuenciación de Siguiente Generación (Next Generation Sequencing).
 
 
 
 
1970s
F. Sanger
Maxam-Gilbert – En Febrero de 1977, en el PNAS figuró una publicación por el doctor Walter Gilbert y su estudiante Allan Maxam de la Universidad de Harvard: “un nuevo método para secuenciar DNA“. Este método se valía de marcadores radiactivos y de degradación química del DNA, con la capacidad de secuenciar al menos 100 bases; los autores señalaban que la principal limitante para lograr lecturas más extensas era la capacidad de resolución de los geles de poliacrilamida utilizados para resolver los fragmentos. Sin embargo, debido a la dificultad técnica para llevar a cabo este método, pronto quedaría desplazado por las tecnologías de secuenciación basadas en terminación de cadena.
W. Gilbert
Desde 1975, Sanger había publicado un método de secuenciación basado en extensión con DNA polimerasa; sin embargo, se requerirían algunas adaptaciones para que su metodología desplazara a la de Maxam y Gilbert.
Por sus contribuciones a la secuenciación de DNA, Sanger y Gilbert (junto con Paul Berg, por sus aportaciones a las tecnologías del DNA recombinante) recibieron el premio Nobel de química en 1980.
1980s
El Dr. Leroy Hood actualmente dirige
un grupo de investigación en el
 Instituto de Biología de Sistemas.
Sin embargo, tanto el método Maxam-Gilbert como el método de terminación de cadena de Sanger, por entonces tenían la desventaja de valerse del uso de marcadores radiactivos. La solución la propondría en una publicación de 1985 el grupo de Leroy Hood en el Caltech: usar nucleótidos conjugados con sondas fluorescentes. En un inicio, la propuesta fue utilizar primers fluorescentes, lo que evolucionaría al uso de dideoxinucleótidos (ddNTPs) fluorescentes.
 
El grupo del Dr. Hood también trabajó en los primeros mecanismos semiautomáticos para secuenciación y a finales de la década, las primeras plataformas de secuenciación comerciales empezaron a popularizarse, principalmente por parte de Applied Biosystems y Pharmacia.
 
 
 
1990s
Durante la década de los 90s, la carrera del proyecto genoma humano atrajo la atención pública hacia la genómica. El instituto Sanger es fundado y comienzan a publicarse las secuencias de los genomas de bacterias y organismos más complejos.
 
La evolución de los sistemas de secuenciación por terminación de cadena siguió su curso con la introducción de sistemas capilares cada vez más sofisticados.
 
 
 
2000-presente
En el 2001 es publicado el primer borrador funcional del genoma humano y en el 2003 el proyecto es declarado completo.
 
La evolución de los sistemas de secuenciación daría un giro completo con la introducción de tecnologías de secuenciación en paralelo, dando lugar a las llamadas tecnologías de “secuenciación profunda” o “de siguiente generación”.
 
Ilustración secuenciación de polonys.
Una polony (PO-lymerase co-LONY o “colonia de polimerasa”) es una colonia de DNA que ha sido amplificado en un sitio determinado.
 
Entre las primeras metodologías para crear polonys están las desarrolladas por Church y Mitra en el MIT, publicadas en 1999, y por el Instituto Serono en Suiza, publicadas en el 2000. Pronto estas metodologías serían adaptadas para diferentes aplicaciones, como cuantificación del efecto relativo de las variantes alélicas en la expresión de un gen, genotipado y haplotipado y secuenciación de DNA.
 
Las adecuaciones del método para secuenciación de DNA fueron llevadas a cabo principalmente en la Escuela de Medicina de la Universidad de Harvard, por parte del grupo del Dr. Church, quienes en conjunto con la Dover Corporation desarrollaron el Polonator Genome Analyzer.
 
Una de las características distintivas de la secuenciación de polonys es que existen en línea recursos gratis para construir equipo y software para analizar los datos obtenidos, hanciendo que esta tecnología de secuenciación sea de libre acceso al público.
 
Pirosecuenciación
Una tarde de invierno de 1986, Pål Nyré, un investigador sueco, salía de su laboratorio y se dirigió en bicicleta hacia Fulbourn. Mientras cualquier otra persona se habría envuelto en su propia rutina, sin pensar en nada en especial al andar en bicicleta, el doctor Nyré concibió la idea de un nuevo método para secuenciar DNA basándose en la liberación de pirofosfato conforme la polimerasa va añadiendo nucleótidos a una cadena de DNA. 
 

Una década después, el doctor Nyré estaría fundando la compañía Pyrosequencing AB (luego Biotage AB), quienes lograrían vender en 1999 el primer sistema automatizado para pirosecuenciación, con la capacidad de secuenciar 96 muestras en paralelo. QIAGEN aquirió en el 2008 la sección de Biosistemas de Biotage AB y actualmente distribuyen una plataforma para 96 muestras, la serie PyroMark Q96.

Preparación de la muestra para secuenciación 454
en Margulies, et al., (2005).
El salto definitivo vendría unos años más tarde, con la introducción de un método para paralelizar masivamente la secuenciación por pirosecuenciación: el método 454, que utiliza reactores de tamaño en el rango de picolitros. Esta tecnología se basa en la amplificación por PCR en emulsión líquido-lípido de fragmentos del DNA a analizar y en instrumentación de fibra óptica para transmitir la señal de luminiscencia.
En el 2000, 454 Life Sciences es fundado y en el 2005 lanzan al mercado la primer plataforma de secuenciación de siguiente generación: el GS 20, con la que Margulies y colaboradores pudieron secuenciar el genoma de Mycoplasma genitalium.
 
En el 2007 Roche adquiere 454 Life Sciences y se desarrolla una nueva versión de la plataforma GS 20: la plataforma GS FLX. Con esta metodología, en el 2008 se publicó la secuenciación del genoma de James Watson, el cual  fue secuenciado en dos meses con un costo equivalente a 1/100 de lo que habría costado secuenciar el mismo genoma utilizando la metodología Sanger.
 
 
Sitios interesantes:

Milestones in DNA technologies
-VIDEO: Genome Sequencer FLX System Workflow
-VIDEO: Pyrosequencing

-VIDEO: The World’s First Personal Genome (Watson/Rothberg) – Part 1

Responder

Introduce tus datos o haz clic en un icono para iniciar sesión:

Logo de WordPress.com

Estás comentando usando tu cuenta de WordPress.com. Cerrar sesión / Cambiar )

Imagen de Twitter

Estás comentando usando tu cuenta de Twitter. Cerrar sesión / Cambiar )

Foto de Facebook

Estás comentando usando tu cuenta de Facebook. Cerrar sesión / Cambiar )

Google+ photo

Estás comentando usando tu cuenta de Google+. Cerrar sesión / Cambiar )

Conectando a %s